ELISPOT檢測的是陽性細(xì)胞的頻率，也就是出斑點(diǎn)的細(xì)胞占整個(gè)加入細(xì)胞的比例。不僅要計(jì)數(shù)斑點(diǎn)，也要計(jì)數(shù)孔中加入的細(xì)胞。每孔加入的細(xì)胞有一個(gè)上限，大約是60萬，這是96孔板每個(gè)孔能容納的細(xì)胞極限，超過這個(gè)極限，細(xì)胞就不再單層平鋪在孔底了。而ELISPOT檢測的前提條件是細(xì)胞單層平鋪在孔底。

理論上說，同一次實(shí)驗(yàn)，孔內(nèi)的斑點(diǎn)數(shù)量應(yīng)該和加入孔中的細(xì)胞數(shù)量成正比，不論加入細(xì)胞多少，陽性細(xì)胞的頻率是恒定的。正是基于這一前提，ELISPOT檢測的單位被定義為，每百萬細(xì)胞中陽性細(xì)胞的數(shù)目，英文SFC/Million (Spots Forming Cells per Million cells)。

但是實(shí)際情況究竟怎樣呢，斑點(diǎn)數(shù)量真的和細(xì)胞數(shù)量成正比嗎？

經(jīng)過反復(fù)的實(shí)踐，我們發(fā)現(xiàn)這條規(guī)律只有在特定的前提下才成立。這個(gè)前提就是有足夠的抗原呈遞細(xì)胞（APC）密度，以滿足細(xì)胞間的相互作用。由于特異性的ELISPOT反應(yīng)都需要APC把抗原呈遞給T細(xì)胞，所以只有APC充足的時(shí)候，斑點(diǎn)數(shù)目才和細(xì)胞數(shù)目成正比。

通常的ELISPOT檢測是不單獨(dú)制備APC的，而是依靠混合在淋巴細(xì)胞中的APC擔(dān)負(fù)抗原呈遞的作用。好在PBMC和小鼠脾臟淋巴細(xì)胞都含有足夠的APC，在特定的細(xì)胞濃度下都會(huì)發(fā)揮正常的抗原呈遞功能。另外，不同的刺激物類型對APC的要求也不一樣，需要具體情況具體分析。

l 非特異性刺激物

非特異性的刺激物可以直接刺激淋巴細(xì)胞，這種刺激不依賴于APC或者其它輔助細(xì)胞，是單細(xì)胞反應(yīng)行為。所以它對細(xì)胞密度沒有要求，在極寬的細(xì)胞濃度范圍之內(nèi)——多至40萬/孔，低至5千/孔——斑點(diǎn)數(shù)量和細(xì)胞數(shù)量都有簡單的正比例關(guān)系，參見圖4.2。但是考慮到，只有恰當(dāng)?shù)陌唿c(diǎn)數(shù)目才便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，所以推薦細(xì)胞密度為10萬/孔。如果細(xì)胞數(shù)目過多，滿孔都會(huì)被斑點(diǎn)覆蓋，并且相互重疊。

l T細(xì)胞表為肽/CEF/ICE

T細(xì)胞表位肽比較特殊。一方面，它需要APC的呈遞，是雙細(xì)胞反應(yīng)行為；另一方面它不需要APC的加工，對于APC的依賴相對較低。以使用ICE多肽庫為例，實(shí)踐中我們發(fā)現(xiàn)在5萬/孔—60萬/孔的細(xì)胞濃度范圍內(nèi)，都可以獲得很好的斑點(diǎn)數(shù)與細(xì)胞數(shù)的線性關(guān)系（參見圖4.2）。通常我們推薦20萬/孔的細(xì)胞密度。如果在這樣的細(xì)胞密度下，斑點(diǎn)過多或者過少，可以根據(jù)實(shí)際情況，在線性范圍許可的限度內(nèi)減少或者增加每孔種植的細(xì)胞密度。

l 普通多肽/蛋白/組織提取物

不論是普通多肽（比如重疊多肽庫）還是蛋白質(zhì)或者蛋白類的組織提取物，這些刺激物都需要APC的攝取、內(nèi)化、加工、呈遞，之后T細(xì)胞才能被刺激。所以，使用這些刺激物的時(shí)候，一定要保證足夠的細(xì)胞密度。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，細(xì)胞密度要至少達(dá)到20萬-30萬每孔。多肽推薦的細(xì)胞密度為30萬/孔，蛋白推薦的細(xì)胞密度為40萬/孔。也可以根據(jù)實(shí)際情況，在線性范圍內(nèi)調(diào)整，參見表4.1與圖4.2。